資源開発分野

マウスバンク

生殖工学技術研修会

IRDA

熊本大学

超過剰排卵誘発剤を用いた体外受精



材料

  1. 生理食塩水（大塚製薬　日本薬局方　大塚生食注）
  2. CARD HyperOva®（九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp）
  3. hCG（あすか製薬　注射用胎盤性性腺刺激ホルモン　動物用ゴナトロピン　3000単位/管）
  4. 1mLシリンジ（テルモ　SS-01T2613S）
  5. FERTIUP®-精子前培養培地（九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp）
  6. CARD MEDIUM（九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp）
  7. mHTF
  8. オートピペッター（GILSON　PIPETMAN　P-200　P-20）
  9. イエローチップ（ビーエム機器　Cat.No.110-96R）
  10. 媒精用チップ（Quality Scientific Plastics Pipet Tip Cat.No.114）
  11. 流動パラフィン（ナカライテスク　Cat.No.26137-85）
  12. ディッシュ（コーニング　35mm X 10mm　Cat.No.430588）
  13. ハサミ 大 解剖用（夏目製作所　反剪刀　Cat.No.B-2）
  14. ハサミ 小 解剖用（夏目製作所　小直剪刀　Cat.No.B-12）
  15. ピンセット 大 解剖用（夏目製作所　先細無鈎ピンセット　Cat.No.A-5）
  16. ピンセット 小 解剖用（夏目製作所　尖鋭ピンセット　Cat.No.A-45）
  17. ノエス剪刀（森田製作所 TEL 03-3811-9730　特注品）
  18. 解剖針（夏目製作所　ブローチホルダー　Cat.No.E-14）
  19. 濾紙
  20. キャピラリー
  21. 倒立顕微鏡
  22. CO2インキュベーター（37°C　5% CO2　95% air）


方法

過排卵処理

１　hCGを、37.5単位/mLとなるように生理食塩水に溶かす。
　＊hCG溶液は、４°Cで約２週間保存可能である。
２　幼若雌マウス（誕生日を０とし、２６～３０日目）に、CARD HyperOva®を0.1〜0.2mL/匹、その４８時間後にhCGを0.2mL/匹　腹腔内投与することにより、過排卵処理を施す（通常、誘発剤およびhCGの投与は午後５～６時に行う）。


ドロップの準備

１　以下の手順で培養液のドロップ（a, b, c）を作製してCO2インキュベーター内で静置し、ガス平衡させる。



　a　精子を採取する３０分前に、精子前培養用ディッシュ（100µLのFERTIUP®-精子前培養培地ドロップ1個）を作製し、インキュベーター内に静置しておく。




　b　採卵１０分前に、受精用ディッシュ（200µLのCARD MEDIUMドロップ1個）を作製し、インキュベータ内に静置する。
　＊体外受精にどのような精子を用いるかで、CARD MEDIUMの調整方法が異なる。取扱説明書を参照すること。




　c　卵子洗浄用ディッシュ（80µLのmHTFドロップ4個）を作製し、インキュベーター内で３０分以上静置する。





精子の採取

全ての解剖器具をアルコール消毒する。

１　１～２匹の成熟雄マウス（３ヶ月～６ヶ月齢）を安楽死させ、ハサミ（大）・ピンセット（大）を用いて精巣上体、精巣および脂肪の一部を取り出し、濾紙上で精巣上体尾部のみを切り取り、血液や脂肪を除去する。
２　切り出した精巣上体尾部を、精子前培養用ディッシュの流動パラフィン中に入れる。


３　ピンセット（小）で精巣上体尾部を固定し、ノエス剪刀で尾部中央の精巣上体管を切開する。
４　解剖針で精巣上体尾部の表面を軽く押さえることにより、精巣上体管切開部から精子塊を押し出す。
５　露出した精子塊を解剖針ですくい取り、FERTIUP®-精子前培養培地のドロップに導入する。
　＊精子前培養培地のドロップ中で、すくい取った精子塊が解剖針の先から離れないときは、解剖針をもう一本使って精子塊をやさしく引き剥がすようにする。

[精巣上体尾部からの精子採取]

６　精子塊をFERTIUP®-精子前培養培地に導入し、CO2インキュベーター内（37°C　5% CO2　95% air）で60分間前培養する。





卵子の採取

全ての解剖器具をアルコール消毒する。

１　過排卵処理を施した雌マウスをhCG投与１５～１７時間後に安楽死させ、卵管のみを切り出し、濾紙上で血液や脂肪を除去する。
２　卵管を、受精用ディッシュ内の流動パラフィン中に沈める。


３　ピンセットで卵管をディッシュの底に押しつけることにより固定し、解剖針で膨大部の卵管壁を引き裂き、放出した卵子塊をCARD MEDIUMのドロップ（200µL）に導入する。


採取した卵管を室温以上の温度域に３分以上放置しておくと、卵子の受精および発生能が著しく低下してしまうため、雌の安楽死から、卵管を採取・卵子塊を受精用CARD MEDIUMドロップに導入するまでの操作は、極力短時間で行う（30秒以内）。
1人で行う場合は、一度に複数の雌を安楽死させるのではなく、1匹ずつ安楽死させ、すばやく採卵する。
１つのCARD MEDIUMドロップに１匹分（２個）の卵子塊を導入する。


４　採卵後、受精用ディッシュをCO2インキュベーター内に静置し、３０～６０分間培養する。





媒精

１　チップ（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）を用いて、前培養した精子懸濁液 約6µLを吸引し、卵子を含む受精用ディッシュのCARD MEDIUMドロップに添加する（媒精）。
２　受精用ディッシュをCO2インキュベーター内（37°C　5% CO2　95% air）で培養する。



３　媒精から3時間後、形態的に正常な卵子のみをガラスキャピラリーで吸引し、新しい卵子洗浄用ディッシュのmHTFドロップに移して（a→b→c）、洗浄をおこなう。
　＊洗浄の際は、極力、CARD MEDIUMを卵子洗浄用ディッシュのドロップに持ち込まないように注意する。





４　媒精から約６時間後、卵子をよく観察し、単為発生卵と判定されたもの（卵細胞質内に１つの前核のみが認められるもの）を取り除き、翌日まで培養する。


＊ 受精卵は、第二極体および雌雄前核が認められるが（写真左）、単為発生卵は１つの前核のみであり（写真右）、未受精卵は前核がまったく認められない（写真右）。



５　翌日（媒精２４～２８時間後）、卵子洗浄用ディッシュの残りのドロップに２細胞期へ発生した胚のみを移し（d）、胚数をカウント後、移植あるいは凍結保存に用いる。
２細胞期胚は胚盤胞期まで体外で培養可能であり、培養を行う際には、KSOM/AAを用いる。


参考文献

  1. Takeo T., Nakagata N. 2015 Superovulation Using the Combined Administration of Inhibin Antiserum and Equine Chorionic Gonadotropin Increases the Number of Ovulated Oocytes in C57BL/6 Female Mice.
    PLoS One. 2015 May 29;10(5):e0128330. doi: 10.1371/journal.pone.0128330.



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