前核期受精卵の凍結

材料

1. 前核期受精卵
2. 1M DMSO
3. DAP213
4. ディッシュ（コーニング　35mm X 10mm　Cat.No.430588）
5. ディスポーザブル・フィルターユニット（ミリポア　ポアサイズ：0.22µm　Cat.No.SLGVJ13SL）
6. 2.5mLシリンジ（テルモ　Cat. No.SS-02SZ）
7. イエローチップ（ビーエム機器　Cat.No.110-96R）
8. ゲルローディングチップ（ビーエム機器　Cat.No.010-R204S）
9. キャピラリー
10. オートピペッター（GILSON　PIPETMAN　P-20　P-100）
11. 凍結用チューブ（SUMILON 1.2mLセラムチューブ インナーキャップ　Cat.No.MS-4501W）
12. クライオカラーコード（NUNC クライオカラーコードミックス　Cat.No.375930）
13. ケーン（マイサイエンス　アンプルケーン　Cat.No.C-7）
14. ケーン用スリーブ（NUNC　Cat.No.5016-0001）
15. ラブトップクーラー（ナルゲン　Cat.No.5116-0012）

　

方法

ラブトップクーラーの準備

１　ラブトップクーラーを、受精卵凍結の前日から冷凍庫（-20°C）で冷却し、使用前に冷凍庫から取り出す。
２　１０分後、凍結用チューブをラブトップクーラーに立てる。
＊ラブトップクーラーは、冷凍庫から取り出してから約１時間、０°C付近の温度域を保っている。従って、その時間内に受精卵の凍結保存を終了するようにする。

前核期受精卵の凍結保存

１　室温にて1M DMSOのドロップ（約100µL）を作製する。1M DMSOは、ディスポーザブル・フィルターユニットを用いて使用直前に濾過する。ドロップの数は凍結するチューブの本数の2倍とする（例えば、凍結するチューブが２本であれば、４個のドロップを作製する）。



２　約100個の受精卵を１つの1M DMSOのドロップに静かに移す。受精卵がディッシュの底に沈んだら、別の1M DMSOのドロップに受精卵を移す。




３　オートピペッター（P-20）を用いて、５µLの1M DMSO溶液とともに受精卵を凍結用チューブの底に入れ、０°Cのラブトップクーラーに移す。

ポイント：ディッシュを前後左右に軽く揺することで、受精卵をドロップの中央に集めてから、受精卵にチップの先端を近づけ、オートピペッターでいっきに吸引する。また、チューブに受精卵を移した後、チップを1M DMSOのドロップ内でピペッティングして、チップ内に受精卵が残っていないことを確認する。




４　５分後、オートピペッター（P-100）を用いて、あらかじめ０°Cに冷却しておいた保存液（DAP213）45µLを、管壁を伝わらせてチューブ内に静かに添加する。
添加したら、チューブのフタを閉める。





５　更に５分後、液体窒素内で冷却しておいたケーンにチューブを装着し、直ちに液体窒素中に浸漬する。
　　＊ フタは、融解時、直ちに開けなければならないため、ゆるめにしておく。

前核期受精卵の融解

１　２細胞期胚の融解と同様の方法で操作を行う。

参考文献

1. Nakagawa Y., Sakuma T., Nakagata N., Yamasaki S., Takeda N., Ohmuraya M., Yamamoto T. 2014 Application of Oocyte Cryopreservation Technology in TALEN-Mediated Mouse Genome Editing. Exp. Anim. 63(3): 349-355.
2. Nakagawa Y., Sakuma T., Sakamoto T., Ohmuraya M., Nakagata N., Yamamoto T. 2015 Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnol. 2015 15:33
3. Nakagawa Y., Sakuma T., Nishimichi N., Yokosaki Y., Yanaka N., Takeo T., Nakagata N., Yamamoto T. 2016 Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5(8): 1142-1148.
4. Nakagawa Y., Sakuma T., Nishimichi N., Yokosaki Y., Takeo T., Nakagata N., Yamamoto T. 2017 Culture time of vitrified/warmed zygotes before microinjection affects the production efficiency of CRISPR-Cas9-mediated knock-in mice. Biol Open. 6(5): 706-713.

更新履歴

• 新規: 2017.09.04
  手順は２細胞期胚の凍結-融解方法とほぼ同じだが、超過剰排卵誘発剤により得られた大量の受精卵を処理するため、100個の受精卵をまとめて操作する。
  100個の受精卵を1M DMSOのドロップで確実に平衡させるため、２細胞期胚の場合より多くのドロップを使う。
  100〜130個の受精卵を１本の凍結チューブで凍結しても問題はない。