胚の凍結
材料
- 1M DMSO
- DAP213
- ディッシュ（コーニング 35mm X 10mm Cat.No.430588）
- ディスポーザブル・フィルターユニット（ミリポア ポアサイズ：0.22µm Cat.No.SLGVJ13SL）
- 2.5mLシリンジ（テルモ Cat. No.SS-02SZ）
- イエローチップ（ビーエム機器 Cat.No.110-96R）
- ゲルローディングチップ（ビーエム機器 Cat.No.010-R204S）
- キャピラリー
- オートピペッター（GILSON PIPETMAN P-20 P-100）
- 胚凍結用チューブ（SUMILON 1.2mLセラムチューブ インナーキャップ Cat.No.MS-4501W）
- クライオカラーコード（NUNC クライオカラーコードミックス Cat.No.375930）
- ケーン（マイサイエンス アンプルケーン Cat.No.C-7）
- ケーン用スリーブ（NUNC Cat.No.5016-0001）
- ラブトップクーラー（ナルゲン Cat.No.5116-0012）
方法
ラブトップクーラーの準備
１ ラブトップクーラーを、胚凍結の前日から冷凍庫（-20°C）で冷却し、使用前に冷凍庫から取り出す。２ 取り出して１０分経過したら、必要な数*の胚凍結用チューブを、ラブトップクーラーに立てる。
＊通常、胚凍結用チューブ１本に、約４０個の胚を入れて凍結保存する（例えば、胚が120個の場合は、胚凍結用チューブ３本を使用する）。
なお、ラブトップクーラーは、冷凍庫から取り出してから約１時間、０°C付近の温度域を保っている。従って、その時間内に胚の凍結保存を終了するようにする。
胚の凍結保存
１ 室温にて1M DMSO>のドロップ（約100µL）を作製する。1M DMSOは、ディスポーザブル・フィルターユニットを用いて使用直前に濾過する。ドロップの数は凍結するチューブの本数プラス１とする（例えば、凍結するチューブが３本であれば、４個のドロップを作製する）。
２ 凍結する胚を１つの1M DMSOのドロップに静かに移す。胚がディッシュの底に沈んだら、残りの1M DMSOのドロップに胚を均等に分けて移す（例えば、１２０個の胚をチューブ３本に分けて凍結する場合は、１つのドロップに１２０個の胚を入れ、続いて、３等分したそれぞれの胚（４０個）を残りの各ドロップへ移す）。
３ オートピペッター（P-20）を用いて、５µLの1M DMSO溶液とともに胚を凍結用チューブの底に入れ、０°Cのラブトップクーラーに移す。
ポイント：ディッシュを前後左右に軽く揺することで、胚をドロップの中央に集めてから、胚にチップの先端を近づけ、オートピペッターでいっきに吸引する。また、チューブに胚を移した後、チップを1M DMSOのドロップ内でピペッティングして、チップ内に胚が残っていないことを確認する。
４ ５分後、オートピペッター（P-100）を用いて、あらかじめ０°Cに冷却しておいた保存液（DAP213）45µLを、管壁を伝わらせてチューブ内に静かに添加する。
添加したら、チューブのフタを閉める。
５ 更に５分後、液体窒素内で冷却しておいたケーンにチューブを装着し、直ちに液体窒素中に浸漬する。
＊ フタは、融解時、直ちに開けなければならないため、ゆるめにしておく。
＊＊ ４および５の操作において、０°Cであれば1M DMSOおよびDAP213での平衡時間が多少延長しても（20分以内）、胚の生存性には影響を及ぼさないので、一度に１０本程度のチューブの凍結が可能である。
[胚の凍結保存]