資源開発分野

マウスバンク

生殖工学技術研修会

IRDA
熊本大学

チューブを用いた精子の凍結と融解


本ページで解説されている精子凍結法はストローを用いて開発されたものであるが、チューブによる精子の凍結も可能である。

材料

  1. 雄マウス(12週齢以上)
  2. 過排卵処理した雌マウス
  3. ノエス剪刀(森田製作所 TEL 03-3811-9730 特注品)
  4. FERTIUP®-精子凍結保存液(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  5. FERTIUP®-精子前培養培地(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  6. CARD MEDIUM(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  7. ディッシュ(コーニング 35mm X 10mm Cat.No.430588)
  8. イエローチップ(ビーエム機器 Cat.No.110-96R)
  9. オートピペッター(GILSON PIPETMAN P-10 P-100)
  10. 凍結保存用チューブ(SUMILON 1.2mLセラムチューブ インナーキャップ Cat.No.MS-4501W)
  11. ケーン(マイサイエンス アンプルケーン Cat.No.C-7)
  12. ケーン用スリーブ(NUNC Cat.No.5016-0001)
  13. 発泡スチロール箱
  14. 発泡スチロール片(厚さ1.5cm)
  15. 液体窒素
  16. 液体窒素保管器
  17. 恒温水槽(37℃)
  18. CO2インキュベーター(37°C 5% CO2 95% air)


方法

精子懸濁液の作製

1 ストローを用いた精子凍結の方法と同様に精子懸濁液の作製を行う。


精子の凍結

1 35μLの精子懸濁液を凍結保存用チューブに入れ、ケーンに装着する。



2 発泡スチロール箱に液体窒素を入れ、発泡スチロール片( 厚さ1.5cm )を浮かべてケーンをのせる。
 *凍結保存用チューブを、液体窒素の液面から 1.5cm 離れた状態で冷却する。





3 発泡スチロール箱のフタを閉めて、10分間静置する。

4 ケーンを発泡スチロール箱から取り出し、素早く液体窒素保管器に入れる。



[液体窒素保管器へのケーンの移動]



精子融解の前の準備

1  ストローを用いた凍結精子の融解方法と同様に未受精卵子を採取し、30~60分間培養しておく。

2 精子を融解する30分前に、精子前培養用ディッシュ(90µLのFERTIUP®-精子前培養培地ドロップ1個)を作製し、インキュベーター内に静置しておく。





精子の融解

1 液体窒素保管器からチューブを取り出し、フタを開けてチューブ内の液体窒素を捨てる。

2  チューブのフタを閉め、10分間37℃の温水中に静置し加温する。





3  10分後、10μLの精子懸濁液を精子前培養用ディッシュのドロップに導入する。
 *1本のチューブから精子前培養用ディッシュ3枚に精子懸濁液を導入する事が可能。



4  3の精子前培養用ディッシュをインキュベーターに入れ、30分間前培養を行う。



5  ストローを用いた凍結精子の融解方法と同様に媒精を行う。









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