資源開発分野

マウスバンク

生殖工学技術研修会

IRDA
熊本大学

精子の融解



材料

  1. 過排卵処理した雌マウス
  2. FERTIUP®-精子前培養培地(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  3. CARD MEDIUM(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  4. mHTF
  5. チップ(Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics
  6. ディッシュ(コーニング 35mm X 10mm Cat.No.430588)
  7. ストロー操作用シリンジ
  8. 恒温水槽(37°C)
  9. 精子融解用フロート
  10. オートピペッター(GILSON PIPETMAN P-10 P-20)
  11. CO2インキュベーター(37°C 5% CO2 95% air)
  12. ハサミ
  13. キムタオル


方法

精子融解用フロートの作製

1 50mL遠沈管と発泡スチロールを下図のように組み合わせ、精子融解に用いるフロートを作製する。




融解前の準備

1 恒温水槽を準備する(37°C)。
2 精子融解用フロートの中に37°Cの温水を満たし、恒温水槽に、下図のように浮かべてセットする。


3 精子を融解する30分前に、精子前培養用ディッシュ(90µLのFERTIUP®-精子前培養培地ドロップ1個)を作製し、インキュベーター内に静置しておく。


4 採卵10分前に、受精用ディッシュ(90µLのCARD MEDIUMドロップ1個)を作製し、インキュベータ内に静置しておく。
 *体外受精にどのような精子を用いるかで、CARD MEDIUMの調整方法が異なる。取扱説明書を参照すること。


5 卵子洗浄用ディッシュ(80µLのmHTFドロップ4個)を作製し、インキュベーター内で30分以上静置しておく。


卵子の採取

1 過排卵処理を施した雌マウスをhCG投与15~17時間後に安楽死させ、採卵した卵子塊を、受精用ディッシュCARD MEDIUMドロップに導入する(1ドロップあたり2~3匹分の卵子塊)。
 *安楽死から、卵管を採取・卵子塊を受精用CARD MEDIUMドロップに導入するまでの操作は、極力短時間で行う(30秒以内)。
 **1人で行う場合は、一度に複数の雌を安楽死させるのではなく、1匹ずつ安楽死させ、すばやく採卵する。

2 採卵後、受精用ディッシュをCO2インキュベーター内に静置し、30~60分間培養する。



精子の融解

1 ピンセットを用いて、液体窒素保管器からストローを取り出し、空気中で5秒間保持し、37°C恒温水槽中のフロート内に素早く移し、10分間加温する。
ポイント:確実に37°Cで加温するために、凍結精子の部分を下方に向けて、ストローを精子融解用フロートへ入れる。
ポイント:凍結・融解したマウス精子は、おかれている周囲の環境の変化に弱いので、精子が動き出す前に粘性が高い精子保存液から粘性の低い培地(FERTIUP®-精子前培養培地)に移すと、融解後の運動性が十分に回復しない。融解したマウス精子は、5分以上37°Cで加温すると動き出すため、必ずストローを10分間37°Cの温水中に静置した後、精子懸濁液を前培養用培地(FERTIUP®-精子前培養培地)に移す。

2 加温後、ストローを37°C恒温水槽中から取りだし、ストロー表面の水分をキムタオルでふき取る。


[液体窒素から取り出して 加温するまで]



精子懸濁液の取り出しと前培養

1 ストローのmHTFとシール部分の間をカットする(ストロー操作用シリンジの内筒を、あらかじめ引いておく)。




2 カットしたストローを、ストロー操作用シリンジに差し込む。




3 ストローをストロー操作用シリンジに差し込むと、ストロー内の圧力が高くなるので、その圧力を抜くため、三方活栓のコックを一回転させる。




4 コックを上に戻し、精子懸濁液とシール部分の間をカットする。




5 シリンジの内筒をゆっくり押して、精子懸濁液のみを精子前培養用ディッシュのドロップに導入する。




6 5の精子前培養用ディッシュをインキュベーターに入れ、30分間前培養を行う。
ポイント:精子が前培養培地へ十分に泳ぎ出すまで、精子前培養用ディッシュは、インキュベーター内へ入れて静置しておく。精子が十分動き出す前にディッシュを揺すったりすると、精子の運動性が回復しない場合があるので、注意する。

[精子懸濁液の取り出しと前培養]




媒精

1 チップ(Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics)を用いて、前培養した精子懸濁液10µLを吸引し、卵子を含む受精用ディッシュCARD MEDIUMドロップに添加する(媒精)。
2 媒精が終了した受精用ディッシュをインキュベーター内にもどして培養する。



[媒精]
ポイント:媒精に用いる精子懸濁液は、良好な精子が集まる前培養液ドロップの辺縁から採取する(下図参照)。
ポイント:精子懸濁液の採取は、1ドロップから3~4回の実施が可能である。
ポイント:精子懸濁液を卵子塊に吹きかけるように、受精用ディッシュのドロップに添加する。







3 媒精から3時間後、形態的に正常な卵子のみを卵子洗浄用ディッシュmHTFドロップ(a→b→c)で洗浄し、さらに翌日まで培養する。
 *洗浄時に透明帯表面に多数の精子が付着している場合は、チップを装着したオートピペッター(20µL)を用いて、受精用ディッシュ内のCARD MEDIUMドロップを20~30回ピペッティングした後、卵子の洗浄を行う。
 **洗浄の際は、極力、CARD MEDIUM卵子洗浄用ディッシュのドロップに持ち込まないように注意する。




4 媒精から約6時間後、卵子をよく観察し、単為発生卵と判定されたもの(卵細胞質内に1つの前核のみが認められるもの)を取り除き、翌日まで培養する。

5 翌日、卵子洗浄用ディッシュの残りのドロップに2細胞期へ発生した胚のみを移し(d)、胚数をカウント後、移植あるいは凍結保存に用いる。







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