資源開発分野

マウスバンク

生殖工学技術研修会

IRDA
熊本大学

CARD法以外の方法で凍結された精子を用いた体外受精



材料

  1. CARD法以外の方法で凍結された精子(クライオチューブ又はストロー)
  2. 過排卵処理した雌マウス
  3. FERTIUP®-精子前培養培地(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  4. CARD MEDIUM(九動株式会社 fertiup(at)kyudo.co.jp)
  5. mHTF
  6. 恒温水槽(37°C)
  7. 精子融解用フロート
  8. ハサミ
  9. キムタオル
  10. 1.5 mL エッペンチューブ(Quality Scientific Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, Natural Cat.No. 509-GRD-Q)
  11. 遠心分離機
  12. オートピペッター(GILSON PIPETMAN P-200 P-1000)
  13. ディッシュ(コーニング 35mm X 10mm Cat.No.430588)
  14. 流動パラフィン(ナカライテスク Cat.No.26137-85)
  15. CO2インキュベーター(37°C 5% CO2 95% air)
 

方法

精子融解用フロートの作製

1 50mL遠沈管と発泡スチロールを下図のように組み合わせ、精子ストローの融解に用いるフロートを作製する。


融解前の準備

1 恒温水槽を準備する(37°C)。

2 精子融解用フロートの中に37°Cの温水を満たし、恒温水槽に、下図のように浮かべてセットする。



3 精子を融解する30分前に、精子前培養用ディッシュ(100µLのFERTIUP®-精子前培養培地ドロップ1個)を作製し、インキュベーター内に静置しておく。




4 採卵10分前に、卵子採取用ディッシュ(200µLのCARD MEDIUMドロップ1個)を作製し、インキュベータ内に静置しておく。
 *体外受精にどのような精子を用いるかで、CARD MEDIUMの調整方法が異なる。取扱説明書を参照すること。



5 卵子洗浄用ディッシュ(80µLのmHTFドロップ4個)を作製し、インキュベーター内で30分以上静置しておく。




未受精卵子の採取と培養

1 過排卵処理を施した雌マウスをhCG投与15~17時間後に安楽死させ、採卵した卵子塊を、卵子採取用ディッシュCARD MEDIUMドロップに導入する(1ドロップあたり3~10匹分の卵子塊)。
 *安楽死から、卵管を採取・卵子塊を受精用CARD MEDIUMドロップに導入するまでの操作は、極力短時間で行う(30秒以内)。
 **1人で行う場合は、一度に複数の雌を安楽死させるのではなく、1匹ずつ安楽死させ、すばやく採卵する。

2 60分間、卵子採取用ディッシュで未受精卵子塊を前培養する。





精子の融解

1 液体窒素保管器タンクからサンプル(凍結精子を含むチューブあるいはストロー)を取り出し、37°C恒温水槽中に素早く移す。
クライオチューブの場合は、素早くフタを開けチューブ内の液体窒素を捨て、恒温水槽に浸す。 ストローの場合は、恒温水槽中のフロート内に素早く移す。



2 1.5mLのエッペンチューブにサンプル内のすべての精子懸濁液を移し、37°Cの1.2mLのmHTFをゆっくりと加え、軽く混和した後、遠心(300g 5分間 室温)する。


3 可能な限り上澄みを除去する(ペレットを含んだ約30µLのmHTFがチューブ下部に残るようにする)。その後、37°CのFERTIUP®-精子前培養培地70µLを加え、軽く混和する。


4 チューブ内のすべての液(約100µL)をそっとチップで吸引し、精子前培養用ディッシュのドロップに加え、30分間 前培養する。




媒精

1 チップを用い、できるだけ少量の培養液とともに前培養した未受精卵子塊を吸引し、融解精子を含む精子前培養用ディッシュのドロップに加え、媒精を行う。




2 媒精から3時間後、形態的に正常な卵子のみを卵子洗浄用ディッシュmHTFドロップ(a→b→c)で洗浄し、さらに翌日まで培養する。



3 媒精から約6時間後、卵子をよく観察し、単為発生卵と判定されたもの(卵細胞質内に1つの前核のみが認められるもの)を取り除き、翌日まで培養する。

4 翌日、卵子洗浄用ディッシュの残りのドロップに2細胞期へ発生した胚のみを移し(d)、胚数をカウント後、移植あるいは凍結保存に用いる。




参考文献

  1. Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta Y., Umeno T., and Tsuchiyama S. 2014. Rescue In Vitro Fertilization Method for Legacy Stock of Frozen Mouse Sperm. J Reprod Dev. 60(2): 168-171

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