用冷冻管冷冻保存小鼠精子

用细管法建立小鼠精子冷冻保存的原方法。然而，冷冻管也可用于冷冻保存。

材料和设备

1. 雄性小鼠（12周龄以上）
2. 超排母鼠
3. 微弹簧剪刀（5mm刀刃）
4. FERTIUP®（冷冻保护液：CPA；COSMO BIO）
5. FERTIUP®（前培养液：MP；COSMO BIO）
6. CARD MEDIUM（COSMO BIO）
7. 塑料培养皿（35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING）
8. 移液器枪头（QSP pipette tip Cat.No.114 Thermo scientific）
9. 微量移液器
10. 冷冻管（推荐 Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan。 也可以使用 366656; NUNC。）
11. 小瓶固定架
12. 泡沫塑料盒
13. 塑料泡沫（15mm 厚）
14. 液氮
15. 液氮罐
16. 37℃ 水浴台
17. 二氧化碳培养箱（37℃, 5% CO2, 95% 空气）

程序

精子悬液的制备

1. 准备精子悬浮液的方法和采样麦管冷冻精子的精子悬浮液准备一样。
   有关信息，请参阅本页。
   
   
   

小鼠精子的冷冻

1. 吸取35μL精子悬液置于冻存管内，将冻存管卡在固定架上。
   
   
   
   
   
2. 液氮倒进泡沫塑料盒子里。放两块泡沫塑料（15mm厚）浮动在液氮表面，把卡有冷冻管的固定架放在两块泡沫塑料上。
   

   注释:	要保持冷冻管在液氮表面15mm以上。

   
   
   
   
   
3. 盖上泡沫塑料盒盖，保持10分钟。
   
   
4. 10分钟后，打开盒盖，迅速将固定架置于液氮罐内。
   
   
   
   
   [冷冻管的冷冻]
   
   
   

准备解冻

1. 收集的卵母细胞放在CARD MEDIUM液滴中，在二氧化碳培养箱中孵化30-60分钟。
   有关进一步信息，请参阅本页。
   
   
2. 冷冻管解冻前30分钟，在培养皿中做1滴（90μL/滴）FERTIUP®(PM)液滴，用液体石蜡覆盖后置于二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2）。
   
   
   

冷冻管内精子悬液的解冻

1. 从液氮罐中取出冷冻管，打开瓶盖，倒出里面的液氮。
   
   
2. 旋紧管盖，将冷冻管置于37℃水浴中保持10分钟。
   
   
   
   
   
   
3. 10分钟后将10μL精子悬液从冷冻管内转移到精子培养皿中的FERTIUP®(PM)中
   

   注释:	1 cryotube can provide enough sperm for 3 sperm dishes .

   
   
   
   
   
4. 将精子培养皿置于二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2）中孵化30分钟。
   
   
   
   
   
5. 使用收集到的卵母细胞和精子在精子培养皿中进行受精，方法与冷冻精子相同。

更新记录

1. 更新 : 1 May, 2018