小鼠胚胎的简易玻璃化冷冻法

材料和设备

1. 1M DMSO
2. DAP213培养液
3. 塑料培养皿 (35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING)
4. 过滤器 (Millex-GV 0.22μm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)
5. 移液器枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)
6. 嘴吸式移液器
7. 冷冻管 (日本推荐用Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, 如果买不到的话可以用 366656; NUNC.)
8. 微量移液器
9. 冷冻管固定架
10. Nalgene 台式冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)
11. 液氮罐

程序

台式冷却器和冷冻管的准备

1. 冷冻前一天，将台式冷却器放在-20℃冰箱里。
2. 在开始玻璃化冷冻前，将台式冷却器从冰箱中取出。
3. 在台式冷却器内放入一些冷冻管（5115-0012; NALGENE, USA），每个冷冻管大约可以保存40枚胚胎，如果要冷冻120枚胚胎，则在冷却器内放置3个冷冻管。
4. 正式开始前，检查管内温度为0℃.

玻璃化冷冻

1. 过滤1M的DMSO溶液同时在培养皿中注入四个1M的DMSO液滴（100μL/液滴），其中一个液滴用于清洗收集液中的胚胎，其他的液滴则用于放置清洗后的胚胎。
   
   
   
   
2. 将收集液中的一组胚胎移入其中的一个液滴内，然后将清洗后的胚胎均匀分配至另外三个液滴中，这些胚胎最终将被转移到冷冻管内。例如，采集了120个胚胎，先将其移入一个DMSO液滴中清洗，然后按照每组40个分别移入另外三个液滴中。
   
   
   
   
   
3. 取一20μL的移液器及凝胶枪头，调整移液量至5μL后吸取所有胚胎，移入冷冻管内，然后将冷冻管放入台式冷却器内在0℃状态平衡5分钟。
   

   注意:	尽可能将冷冻管放在0℃冷却器内可超过5分钟 (<20分钟).

   注意:	吸取胚胎前，先将培养皿旋转几下使胚胎集中在液滴中央，以便于吸入5μL的1M的DMSO溶液中包含所有胚胎。

   
   
   
   
   
   
   
   
4. 加入预先放置在0℃冷却器内平衡的抗冷冻液（DAP213）45μL，再平衡5分钟。
   
   
   

   注意:	加入DAP213溶液后，不要将冷冻管盖旋得太紧，否则，从冷冻容器中取出样品时很难快速打开。





5. 迅速将冷冻管卡入固定夹后直接浸入液氮中。
   
   
   

参考文献

1. Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos. Exp. Anim. 46(3): 231-234.
   
   

更新记录

1. 更新 : 1 July, 2018