2-细胞胚胎的低温运输

材料和设备

1. 2细胞胚胎 (适用于新鲜和冷冻/解冻胚胎)
2. 塑料培养皿 (35mm x 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
3. 移液器枪头 (Cat. No. 010-R204S; Bio Medical Instrument)
4. M2溶液 (Cat. No. M7167; Sigma)
5. 0.5mL 管子 (Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5mL; Fisher Scientific Cat. No. FS-MCT-060-C)
6. 嘴吸式移液器
7. KSOM/AA培养液
8. 温度数据记录仪 (Thermochron iButton Cat.No.DS1921G; Maxim Integrated Products)
9. CARD低温的运输套装 (COSMO BIO)
   • Thermos 保温瓶 (Cat.No.JMK-501; Thermos K.K.)
   • 纸盒 (0.5mL 管子能直立)
   • 药棉
   • 冰袋 (小的和大的)
   • 聚苯乙烯泡沫输送箱 (KARUX KC-3)

程序

2细胞胚胎的冷藏

1. 在塑料培养皿中做两个100μL的M2液滴。
2. 将2细胞胚胎中培养液中转移到M2液滴中。
   
   
   
   
   
   
3. 改用新的毛细管操作胚胎，并将胚胎吸入新的毛细管中，以避免将液体石蜡滴在M2液滴上。
   将胚胎转移到步骤1中的M2滴中。
   
   
   
   
   
   
   
   
   
4. 在室温下用0.6mL的M2液填充0.5mL的管。如果在管子底部存在气泡，则敲击管子顶端以释放气泡。
   
   
   
   
   
   
   
5. 吸取胚胎并移入管子底部（40枚胚胎/管子）。
   
   
   
   
   
   
   
6. 将装有胚胎的管子、温度数据记录器和一块药棉放在纸盒里。
   
   
   
   
   
   
7. 把纸盒放在冰箱里（4-8℃）。
   

   注释:	胚胎将维持长达72小时的发育能力。

2细胞胚胎的包装和运输

用上述方法制备含有2-细胞胚胎的纸盒（2细胞胚胎的冷藏）。
在使用前，冰袋（大）和泡沫输送箱必须预先冷却至4-8℃。冰袋（小）和保温瓶在室温下使用。

1. 将含有胚胎的纸盒插入保温瓶中。
   
   
   
   
   
   
2. 把两个冰袋（小）放进保温瓶里。
   
   
   
   
   
   
3. 拧上瓶盖。
   
   
   
   
   
   
   
   
4. 在泡沫运输箱底部放一个冰袋（大），然后把保温瓶放在上面。
   
   
5. 在瓶子上面两侧各放一个冰袋（大），然后在这上面和泡沫盖之间放置一个更大的冰袋（大）。
   

   注意:	注意不要把纸盒倒置。

   注意:	由于热水瓶的长度与泡沫输送箱的内长相同，所以只能将热水瓶放在泡沫输送箱的中心而不是实际的底部。这是为了在运输过程中保护保温瓶。

   
   
6. 用包装胶带密封泡沫运输箱的盖子。
   
   
   
   
   
   
7. 把泡沫运输箱放在冰箱里直到快递员来取。
   
   
8. 通过正规的快递服务公司寄送样品。

   注意:	样品必须在冷藏温度下传送。请随时直接向快递公司询问运输过程中的情况。

   注释:	胚胎在低温下保持发育能力可长达72小时。

从运输盒中回收2细胞胚胎

1. 将3滴（100μL/滴）KSOM/AA放入培养皿中，用液体石蜡覆盖。将培养皿放在培养箱（37℃，空气中含5%的CO2）孵化至少30分钟。
   
   
   
   
   
2. 从保温瓶中取出装有样品的纸盒。
   
   
3. 纸盒在室温下放置30分钟。

   注释:	胚胎在这30分钟内会沉到管底。

   
   
   [取出样品]
   
   
   
   
   
4. 打开纸盒，轻轻移去里面的棉花。一次性取出所有的含有胚胎的管子并打开管盖。
   
   
5. 用移液器枪头从管中吸取200μL的 M2上层溶液，然后均匀地释放到塑料培养皿的边缘。
   
   
   
   
   
   
6. 用微量移液器的移液管从管子底部仔细吸取含有胚胎的M2溶液，然后转移到塑料培养皿的中间。

   注意:	为了便于操作，微量移液器枪头中避免有空气泡。

   
   
   
   
   
   
7. 从M2溶液中收集胚胎，然后转移到转移到三个100μL的KSOM/AA液滴中依次清洗。
   

   注意:	如果没有收集到所有储存的胚胎，则应该在塑料培养皿边缘的200μL的M2溶液中。

   
   
   
   
   
   
8. 将胚胎移植至假孕小鼠的输卵管中。

   注释:	比较理想的是，得到胚胎后立刻移植给假孕小鼠。

参考文献

1. Takeo T., Kaneko T., Haruguchi Y., Fukumoto K., Machida H., Koga M., Nakagawa Y., Takeshita Y., Matsuguma T., Tsuchiyama S., Shimizu N., Hasegawa T., Goto M., Miyachi H., Anzai M., Nakatsukasa E., Nomaru K., and Nakagata N. 2009. Birth of mice from vitrified/warmed 2-cell embryos transported at a cold temperature. Cryobiology. 58(2): 196-202.
2. Takeo T., Kondo T., Haruguchi Y., Fukumoto K., Nakagawa Y., Takeshita Y., Nakamuta Y., Tsuchiyama S., Shimizu N., Hasegawa T., Goto M., Miyachi H., Anzai M., Fujikawa R., Nomaru K., Kaneko T., Itagaki Y., and Nakagata N. 2010. Short-term storage and transport at cold temperatures of 2-cell mouse embryos produced by cryopreserved sperm. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49(4): 415-419.

更新记录

1. 更新 : 1 July, 2018