胚胎输卵管内移植

在我们实验室，2-细胞胚胎是通过假孕受体母鼠的输卵管的壁进行移植的。这种移植方法比传统的胚胎移植方法更为容易和方便。尤其适合于没有经验的操作人员。

材料和设备

1. 假孕1天的雌鼠（见到阴栓为第1天）
   
   
   
   
   
2. 显微鼻科剪刀（5mm刀刃）
   
3. 一副5#钟表镊
   
4. 微弹簧夹
   
5. 皮肤夹（Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630）和皮肤缝合机（Autoclip 9 mm; Clay Adams 427631）
   
6. 塑料培养皿（35mm×10mm Cat.No.430588；CORNING）
   
7. 胚胎移植用玻璃毛细管

程序

小鼠的准备

1. 雌性小鼠进行麻醉。
   
   
2. 按照常规程序进行手术，从雌鼠腹腔内取出卵巢、输卵管和子宫角的一部分。
   
   
   
   
   
3. 微夹夹住附着于卵巢囊的脂肪垫。
   
   
   

输卵管定位

如下图所示，胚胎移植进入输卵管是通过切开输卵管，插入毛细血管并将胚胎移向壶腹。



遗憾的是，小鼠输卵管小、管折叠成复杂的方式，我们可以看到下面的一个形象化的输卵管示意图（A）。
因为插入是从上面进行的，这使得玻璃毛细管插入输卵管到壶腹部非常困难。
为了使这个过程更容易，在开始操作前，通过改变微夹和小鼠的位置来定位输卵管（B）。

1. 在体视显微镜下用一组镊子或通过改变微夹的位置观察输卵管和确认漏斗部和膨大部的位置。
   
   
2. 通过改变微夹和小鼠的体位对输卵管进行定位。

   注意:	因为输卵管之间的褶皱在每只小鼠之间有差异，仔细观察并调整输卵管的位置，使输卵管的操作更容易。

   点评:	如果你是左撇子，调整输卵管位置，这样你就可以很容易地用左手进行操作。

胚胎和玻璃毛细管的准备

1. 在培养皿中（无石蜡油）做一个200μL的KSOM/AA液滴，在液滴中移入20枚胚胎。
   
   
   
   
   
2. 间隔2-3mm轮换抽吸空气和培养液制作胚胎移植用玻璃毛细管。在玻璃毛细管中吸入十个胚胎。
   
   
   
   
   

   点评:	当玻璃毛细管首次插入液滴时，液体石蜡会留在液滴的外表面，如下图所示。胚胎应从滴滴的另一侧吸入玻璃毛细管，以避免吸入液体石蜡。 有证据表明，进入输卵管的液体石蜡可能对胚胎发育产生不利影响。

   
   
   

胚胎移植

1. 取一个精细钟表镊和一把弹簧剪刀，在输卵管伞部与膨大部之间剪一小口。
   
   
   
   
   
   
2. 将含有胚胎的毛细血管前端插入切口，然后将毛细血管进一步插入切口至壶腹。
   
   
   
   
   
3. 用镊子固定住插入毛细移液管的输卵管开口部。
   
   
4. 将胚胎和2-3个空气泡吹入输卵管膨大部。
   

   点评:	如果操作正确，你可以通过膨大部壁看到里面的空气泡。

   注意:	如果你不能将胚胎和气泡吹入输卵管，则把毛细管往切口方向退出一点，然后再吹出（胚胎和空气泡）。

   
   
   
   
   
5. 从切口轻缓地取出毛细移液管。
   
   
   
   
   
   
   [胚胎的输卵管移植]
   
   
   

   注意:	调整输卵管位置和方向后移植胚胎。如果毛细移液管是顺着输卵管的方向，则很容易地将毛细移液管插入到输卵管的切口内。

   
   
   
6. 将卵巢、输卵管和子宫角等放回小鼠腹腔内，用自动皮肤缝合机缝合皮肤。
   
   
   
   
   
7. 重复上述过程，将余下的10枚胚胎移植到另一侧输卵管。


8. 将术后小鼠置于37℃的保温台上直至苏醒。

参考文献

1. Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.
2. Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.

更新记录

1. 更新 : 1 May, 2018