小鼠卵母细胞的简易玻璃化冷冻法

材料和设备

1. 用PMSG和hCG超排的雌性小鼠
2. 塑料培养皿 (35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING)
3. 石蜡油
4. 嘴吸式移液器
5. 移液器枪头
6. mHTF液
7. 含有1%透明质酸酶的mHTF液
8. 胎牛血清（FBS Cat.No.26140-087; Gibco）
9. 过滤器 (Millex-GV 0.22μm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)
10. 用于胚胎处理的玻璃毛细管
11. 培养箱 (37℃, 5% CO2, 95% 空气)
12. 用于胚胎玻璃化冷冻和复苏的材料和设备（用于清洗复苏的卵母细胞，mHTF液滴）。

程序

培养皿的准备

1. 在培养皿中做一个200μL的mHTF液滴，用石蜡油覆盖后置于培养箱（37℃, 5% CO2, 95% 空气）中孵化30分钟以上。
   
   
   
   
   
   
2. 在培养皿中做4个mHTF液滴（80μL/滴），用石蜡油覆盖后置于培养箱（37℃, 5% CO2, 95% 空气）中孵化30分钟以上。
   
   
   
   
   
   
3. 准备一些含有20%胎牛血清的mHTF液，过滤除菌后，在培养皿中做2个液滴（100μL/滴），用石蜡油覆盖后置于培养箱（37℃, 5% CO2, 95% 空气）中孵化30分钟以上。
   
   
   
   
   
   

裸卵的准备

1. 从超排卵雌性小鼠收集卵丘卵母细胞复合体（COCs），并将其移入200μL的mHTF（卵母细胞培养皿）液滴中。
   

   注意:	为确保所有操作顺利，从处死雌鼠和移除输卵管，到将COCs引入到一个mHTF（卵母细胞培养皿）液滴中，尽可能地在最短的时间内（在30秒内）完成。此外，在进行这一过程时，不要同时处死多个小鼠；相反，在操作下一个母鼠前，尽快地处死小鼠并取出输卵管。



2. 将20μL的1%透明质酸酶加到含有COCs的mHTF液滴中，将培养皿放在培养箱（37℃，空气中含5%个CO2）中1分钟。
   
   



3. 立即收集卵母细胞并转移至80μL的mHTF（清洗培养皿）液滴中，然后依次移入清洗培养皿的其他液滴中清洗。
   

   备注:	如果一些卵丘细胞附着在卵母细胞的透明带上，可以通过操纵玻璃毛细管将它们去除。

   
   
   
   
   
   

在含FBS的液滴中培养卵母细胞

1. 将卵母细胞转移到FBS培养皿中的第一个液滴中漂洗。然后，将再转移到第二个液滴中放入培养箱孵育（37℃，空气中含5%的CO2）10分钟。
   

   备注:	FBS能防止卵母细胞在玻璃化冷冻和复苏过程中其透明带变硬。

   
   
   

小鼠卵母细胞的简易玻璃化冷冻

1. 小鼠卵母细胞可以在去除卵丘细胞后，在含有FBS的液滴中培养，再用简单的玻璃化方法对卵母细胞进行冷冻。
   此外，复苏方法与胚胎相同。
   

   备注:	mHTF液滴可用于卵母细胞的清洗和复苏。

   
   

用冻融的卵母细胞进行体外受精

1. 冻融的卵母细胞可以用新鲜的、冻融的或低温运输的精子进行体外受精。

   注意:	有三种不同的制备CARD MEDIUM的方法，这取决于是使用新鲜的、冻融的还是低温输送的精子进行体外受精。 具体请参阅CARD MEDIUM说明书。

参考文献

1. Nakagata N, Takeo T, Fukumoto K, Kondo T, Haruguchi Y, Takeshita Y, Nakamuta Y, Matsunaga H, Tsuchiyama S, Ishizuka Y, Araki K. 2013. Applications of cryopreserved unfertilized mouse oocytes for in vitro fertilization. Cryobiology. Oct;67(2):188-92.

更新记录

1. 更新 : 1 July, 2018