小鼠的精子冷冻

冷冻保存后，本页有利用冷冻精液进行体外受精的详细步骤。

材料和设备

1. 雄性小鼠（12周龄以上）
2. 微弹簧剪刀（5mm刀刃）
3. 一副5#钟表镊子
4. FERTIUP®（冷冻保护液：CPA；COSMO BIO）
5. mHTF培养液
6. 塑料培养皿（35mm×10mm Cat.No.430588；CORNING）
7. 移液器枪头
8. 麦管（PETG sperm straw 0.25mL, Cat. No.010261; Cryo Bio System or Mini Straw, Cat. No.005565; IMV Technologies）
9. 微量移液器
10. 麦管连接器
11. 脉冲封口机
12. 预冷罐
13. 低温生物容器
14. 热台

程序

预冷罐的制作

1. 将一个泡沫塑料塞入50ml的注射器的底部。
   
   
2. 将注射器连接针头处加热封口。
   
   
3. 将注射器固定在亚力克（塑胶）杆上。
   
   
   

准备麦管连接件

1. 用1mL注射器、三通旋塞阀，一段乳胶管、塑料管、乳胶帽，如下图所示连接起来。
   
   
2. 组装麦管连接件，将麦管的棉花塞端剪开，然后将麦管连接到连接器末端的硅橡胶盖。
   
   
   

精子悬液的制备

1. 在35mm的塑料培养皿中做一个60μL FERTIUP®（CPA）液滴，用液体石蜡覆盖液滴。
   
   
2. 在液滴中再添加60μL的相同的培养液（最后容积为120μL）做一个更高的半球形液滴。将培养皿置于37度的恒温台上直到使用。
   
   
   
   
   
   
3. 颈椎脱臼处死一只雄性小鼠（＞12周），无菌条件下取出两个附睾尾。
   
   
4. 将附睾尾部放在滤纸上，在显微镜下清除所有脂肪和血液。
   
   
5. 将附睾尾部转移到FERTIUP® （CPA）液滴中，用5#钟表钳固定后用微弹簧剪刀在附睾上剪5-6个切口。
   
   
   
   
   
   
6. 将培养皿放在37度的热台上3分钟，期间，每分钟摇动一下培养皿，使精子从附睾中释放出来。
   
   
   
   [附睾的切口与精子悬液的制备]
   
   
   

含有精子悬液的冷冻麦管的准备

1. 把麦管连接到麦管连接器上。
   
   
2. 按以下顺序小心地吸入麦管：
   a. 100μL mHTF溶液；
   b. 15mm的空气；
   c. 10μL 精子悬液；
   d. 再一个15mm空气。
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
3. 用脉冲封口机密封麦管的两头。
   

   注释:	麦管中加入100μL的mHTF是为了防止麦管漂浮在液氮表面。因为mHTF具有一定的重量可以使麦管沉入到液氮中。

   
   
   
   
   
4. 按照上述方法做10根麦管。

精子冷冻用低温生物容器

1. 把样品放入预冷罐并将其漂浮在低温生物容器的液氮表面。
   
   
2. 10分钟后，快速将预冷罐浸入液氮中。
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   [麦管冷冻]
   
   
   
   
   
3. 取出装满液氮的预冷罐，然后将麦管转移到一个三角盒中，再储存在液氮罐中。
   
   
   

利用干运输盒进行精子冷冻

1. 将含有精液的麦管放入三角盒中。
   
   
2. 再将三角形盒放在预冷罐中。
   
   
3. 重复把三角盒放到干运输盒的预冷罐里，再移开10分钟。
   

   注释:	利用干运输盒进行精子冷冻，液适用于运输冷冻保存的精子。

   
   
   

参考文献

1. Nakagata N., and Takeshima T. 1992. High fertilizing ability of mouse spermatozoa diluted slowly after cryopreservation. Theriogenol. 37: 1283-129.
2. Nakagata N., Ueda S., Yamanouchi K., Okamoto K., Matsuda Y., Tsuchiya T., Nishimura M., Oda S., Koyasu K., Azuma S., and Toyoda Y. 1995. Cryopreservation of wild mouse spermatozoa. Theriogenol. 43: 635-643.
3. Nakagata N. 1996. Use of cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa for production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines. Lab. Anim. Sci. 46: 236-238.
4. Okamoto M., Nakagata N., Ueda O., Kamada N., and Suzuki H. 1998. Cryopreservation of gene disrupted mouse spermatozoa. J. Mamm. Ova. Res. 15: 77-80.
5. Takeo T., Hoshii T., Kondo Y., Toyodome H., Arima H., Yamamura KI., Irie T., and Nakagata N. 2008. Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after freezing and thawing by facilitating cholesterol efflux from the cells. Biol Reprod. 78(3): 546-51.
6. Takeo T., and Nakagata N. 2010. Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamine and methyl-β-cyclodextrin in a preincubation medium yields a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab. Anim. 44(2): 132-7.
7. Nakagata N. 2011. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods Mol Biol. 693: 57-73.
8. Nakagawa Y., Fukumoto K., Kondo T., Koga M., Takeshita Y., Nakamuta Y., Sakaguchi M., Haruguchi Y., Tsuchiyama S., Kaneko T., and Nakagata N. 2009. Fertilization ability of C57BL/6J mouse spermatozoa frozen in a dry shipper. Exp. Anim., 58(3) Suppl: 297.

更新记录

1. 更新 : 1 May, 2018