小鼠受精卵的简易玻璃化冷冻

材料和设备

  1. 从超超排卵雌性小鼠获得的受精卵
  2. 1M DMSO抗冷冻液
  3. DAP213培养液
  4. 塑料培养皿 (35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING)
  5. 过滤器 (Millex-GV 0.22μm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)
  6. 移液器枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)
  7. 嘴吸式移液器
  8. 冷冻管 (日本推荐用Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, 如果买不到的话可以用 366656; NUNC.)
  9. 微量移液器
  10. 冷冻管固定架
  11. Nalgene 台式冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)
  12. 液氮罐

程序

台式冷却器和冷冻管的准备

  1. 冷冻前一天,将台式冷却器放在-20℃冰箱里。
  2. 在开始玻璃化冷冻前10分钟,将台式冷却器从冰箱中取出。
  3. 在台式冷却器内放入一些冷冻管(5115-0012; NALGENE, USA)。
  4. 正式开始前,检查并确认管内温度为0℃。

玻璃化冷冻

  1. 过滤1M的DMSO溶液同时在培养皿中注入四个1M的DMSO液滴(100μL/液滴),其中2个液滴用于清洗收集液中的卵母细胞,其他的液滴则用于放置清洗后的胚胎。


  2. 将收集液中的一组100个卵母细胞移入其中的一个液滴内。将漂洗后的卵母细胞转移到其他滴液中。
    用于冲洗或保持卵母细胞的液滴一滴只用一次,不要重复使用,因为1M DMSO被稀释了。



  3. 取一20μL的移液器及凝胶枪头,一次吸取5μL的含有卵母细胞的1M DMSO溶液移入冷冻管内,然后将冷冻管放入台式冷却器内在0℃状态平衡5分钟。
    注意: 如果吸取胚胎前先将胚胎推到液滴中央,以便于吸入5μL的1M的DMSO溶液中包含所有卵母细胞。





  4. 加入预先放置在0℃冷却器内平衡的抗冷冻液(DAP213)45μL,再平衡5分钟。

    注意: 加入DAP213溶液后,不要将冷冻管盖旋得太紧,否则,从冷冻容器中取出样品时很难快速打开。



  5. 迅速将冷冻管卡入固定夹后直接浸入液氮中。

复苏

  1. 参照2-细胞期胚胎的程序复苏卵母细胞


参考文献

  1. Nakagawa Y., Sakuma T., Nakagata N., Yamasaki S., Takeda N., Ohmuraya M., Yamamoto T. 2014 Application of Oocyte Cryopreservation Technology in TALEN-Mediated Mouse Genome Editing. Exp. Anim. 63(3): 349-355.
  2. Nakagawa Y., Sakuma T., Sakamoto T., Ohmuraya M., Nakagata N., Yamamoto T. 2015 Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnol. 2015 15:33.
  3. Nakagawa Y., Sakuma T., Nishimichi N., Yokosaki Y., Yanaka N., Takeo T., Nakagata N., Yamamoto T. 2016 Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5(8): 1142-1148.
  4. Nakagawa Y., Sakuma T., Nishimichi N., Yokosaki Y., Takeo T., Nakagata N., Yamamoto T. 2017 Culture time of vitrified/warmed zygotes before microinjection affects the production efficiency of CRISPR-Cas9-mediated knock-in mice. Biol Open. 6(5): 706-713.


更新记录

  1. 更新 : 1 July, 2018