小鼠受精卵的简易玻璃化冷冻

材料和设备

1. 从超超排卵雌性小鼠获得的受精卵
2. 1M DMSO抗冷冻液
3. DAP213培养液
4. 塑料培养皿 (35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING)
5. 过滤器 (Millex-GV 0.22μm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)
6. 移液器枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)
7. 嘴吸式移液器
8. 冷冻管 (日本推荐用Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, 如果买不到的话可以用 366656; NUNC.)
9. 微量移液器
10. 冷冻管固定架
11. Nalgene 台式冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)
12. 液氮罐

程序

台式冷却器和冷冻管的准备

1. 冷冻前一天，将台式冷却器放在-20℃冰箱里。
2. 在开始玻璃化冷冻前10分钟，将台式冷却器从冰箱中取出。
3. 在台式冷却器内放入一些冷冻管（5115-0012; NALGENE, USA）。
4. 正式开始前，检查并确认管内温度为0℃。

玻璃化冷冻

1. 过滤1M的DMSO溶液同时在培养皿中注入四个1M的DMSO液滴（100μL/液滴），其中2个液滴用于清洗收集液中的卵母细胞，其他的液滴则用于放置清洗后的胚胎。
   
   
   
   
2. 将收集液中的一组100个卵母细胞移入其中的一个液滴内。将漂洗后的卵母细胞转移到其他滴液中。
   用于冲洗或保持卵母细胞的液滴一滴只用一次，不要重复使用，因为1M DMSO被稀释了。
   
   
   
   
   
3. 取一20μL的移液器及凝胶枪头，一次吸取5μL的含有卵母细胞的1M DMSO溶液移入冷冻管内，然后将冷冻管放入台式冷却器内在0℃状态平衡5分钟。
   

   注意:	如果吸取胚胎前先将胚胎推到液滴中央，以便于吸入5μL的1M的DMSO溶液中包含所有卵母细胞。

   
   
   
   
   
   
   
   
4. 加入预先放置在0℃冷却器内平衡的抗冷冻液（DAP213）45μL，再平衡5分钟。
   
   
   

   注意:	加入DAP213溶液后，不要将冷冻管盖旋得太紧，否则，从冷冻容器中取出样品时很难快速打开。





5. 迅速将冷冻管卡入固定夹后直接浸入液氮中。
   
   
   

复苏

1. 参照2-细胞期胚胎的程序复苏卵母细胞

参考文献

1. Nakagawa Y., Sakuma T., Nakagata N., Yamasaki S., Takeda N., Ohmuraya M., Yamamoto T. 2014 Application of Oocyte Cryopreservation Technology in TALEN-Mediated Mouse Genome Editing. Exp. Anim. 63(3): 349-355.
2. Nakagawa Y., Sakuma T., Sakamoto T., Ohmuraya M., Nakagata N., Yamamoto T. 2015 Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnol. 2015 15:33.
3. Nakagawa Y., Sakuma T., Nishimichi N., Yokosaki Y., Yanaka N., Takeo T., Nakagata N., Yamamoto T. 2016 Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5(8): 1142-1148.
4. Nakagawa Y., Sakuma T., Nishimichi N., Yokosaki Y., Takeo T., Nakagata N., Yamamoto T. 2017 Culture time of vitrified/warmed zygotes before microinjection affects the production efficiency of CRISPR-Cas9-mediated knock-in mice. Biol Open. 6(5): 706-713.
   
   

更新记录

1. 更新 : 1 July, 2018