玻璃化冷冻胚胎的复苏程序

材料和设备

1. 显微镜
2. 0.25 M 蔗糖溶液
3. KSOM/AA培养液
4. 塑料培养皿 (35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING)
5. 嘴吸式移液器
6. 微量移液器

程序

复苏的准备

1. 在培养皿中做三个KSOM/AA液滴（100μL/滴），用石蜡油封面，置于培养箱（37℃, 空气中含5% CO2 ）中孵化30分钟以上。
   
   
2. 0.25M的蔗糖溶液使用前在培养箱（37℃, 空气中含5% CO2 ）中预热。

玻璃化胚胎的回收

1. 从液氮罐中取出所需解冻的冷冻管，打开冷冻管盖子，废弃管内液氮，在室温下放置30秒钟。
2. 用1mL微量移液器取预先加热至37℃的0.25M的蔗糖溶液0.9mL，吹打10来次后将管内溶液移入培养皿中。需注意的是，如果吹打过程中操作不当，会产生许多空气泡。将0.25M蔗糖（预热至37℃）加入冷冻管中，通过快速来回吸液加热样品。吹吸溶液时，要小心不要产生大量的气泡，也不要速度太快而非物理地破坏胚胎。一次性加热后，将冷冻管的内容物转移到塑料培养皿中。
   
   
   
   
   
   
   
   
3. 将0.4-0.5mL的0.25M的蔗糖放入冷冻管中，然后吸取内容物转移到塑料培养皿中，这样有助于稀释冷冻保护剂并确保所有的胚胎都能进行移植。
   
   
   [玻璃化胚胎的回收]
   
   
   注意: 快速解冻可以避免冷冻保护液（DAP213）的毒性对胚胎可能造成的损伤。
   
   
   
   
   
   [移液器回收玻璃化胚胎]
   
   
   
   
   
4. 从液滴中吸取胚胎并小心地转移到一滴KSOM/AA（清洗培养皿）中，然后置于培养箱（37℃，空气中含5%的CO2）中。
   
   
   
   [显微照片：玻璃化冷冻复苏后的胚胎]
   
   
   
   
5. 10分钟后，用新鲜的KSOM/AA（清洗培养皿）清洗胚胎二次。
   
   
   
   
   

参考文献

1. Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos. Exp. Anim. 46(3): 231-234.

更新记录

1. 更新 : 1 July, 2018