传统种群冷冻精子的营救性体外受精
材料和设备
- 传统冷冻精子
- 用PMSG和hCG超排的母鼠
- FERTIUP®（前培养液：PM；COSMO BIO）
- CARD MEDIUM（COSMO BIO）
- mHTF
- 维持37℃的水浴箱
- 用于解冻的漂浮物
- 1.5mL 试管 (Quality Scientific Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, Natural Cat.No. 509-GRD-Q)
- 离心机
- 微量移液器
- 塑料培养皿（35mm x 10mm Cat.No.430588; CORNING）
- 加湿培养箱（37℃, 5% CO2, 95% 空气）
程序
解冻用漂浮物的制备
- 利用一些泡沫塑料和1个50mL的塑料离心管按下图所示制作1个漂浮物。
准备解冻
- 准备一个37℃的水浴箱。
- 将纯水（37℃）加入到50mL离心管内至漂浮物高度，使其漂浮在水浴箱中。
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在精子冷冻麦管解冻前30分钟，在培养皿中做一滴（100μL/滴）的FERTIUP®(PM)，用石蜡油封面，置于二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2）。
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在采集卵母细胞前10分钟，在培养皿中做一滴（200μL/滴）的CARD MEDIUM，用石蜡油封面，置于二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2）。
注意: 有三种不同的方法来准备CARD MEDIUM，这取决于是使用新鲜的、冻融的还是低温冷藏的精子来进行体外受精。
请参阅CARD MEDIUM说明手册。
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在培养皿里做4滴（80μL/滴）mHTF培养液滴，用液体石蜡覆盖。然后把培养皿放在培养箱（37℃，5% CO2）里至少30分钟。
卵母细胞的收集和预培养
- hCG处理15-17小时后处死雌性小鼠，取出输卵管。
- 用精细镊子、解剖针刺破输卵管壶腹部，释放出6-20团卵丘卵母细胞复合体（COCs），并把它们拖到CARD MEDIUM（200μL）中（受精培养皿），预培养60分钟。
注意: 从处死母鼠到取出输卵管，再将卵丘复合体引入到CARD MEDIUM液滴中，所有操作尽可能在较短的时间内完成（30秒以内）。此外，在进行这一过程时，不要同时处死多个小鼠；相反，在操作下一个母鼠前，尽快地处死小鼠并取出输卵管。
小鼠精子的解冻
- 从液滴中取出1根麦管，如果储存在冷冻管内，打开管盖并倒去里面的液氮。迅速将样品放入置于37℃恒温水浴箱（使用聚苯乙烯泡沫塑料或聚苯乙烯泡沫塑料/离心管组件组成）10分钟。
- 将精子悬液从冷冻管或麦管中转移到1.5mL的小管中。在管内缓慢加入1.2mL的37℃的mHTF，室温下在300 g下离心5分钟。
- 离心后，尽可能多地去除上清液，在管内加入70μL的FERTIUP®(PM) 培养液保持在37℃内（最终体积约为100μL）。
- 用移液器轻轻吸取管内的所有内容物并转移到100μL 的FERTIUP®(PM) 液滴中。将培养皿放在培养箱（37℃，空气中5%的CO2）放置30分钟。
人工授精
- 使用移液器枪头，从CARD MEDIUM（卵母细胞培养皿）中用最少量的培养基吸取预培养的COCs。然后将其释放到精子悬液（精子培养皿）中，并在培养箱（37℃，空气中5%的CO2）中培养。
- 培养3小时后，在清洗培养皿中用新鲜的mHTF（80μL）洗卵3次。
- 授精6小时后，在第三滴mHTF液滴中观察授精情况，去除只有一个原核的孤雌卵母细胞。
- 卵母细胞培养过夜，将获得的2-细胞期胚胎转移到第四滴mHTF液滴中。这些胚胎可以被玻璃化冷冻或移植。
参考文献
- Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta Y., Umeno T., and Tsuchiyama S. 2014. Rescue In Vitro Fertilization Method for Legacy Stock of Frozen Mouse Sperm. J Reprod Dev. 60(2): 168-171
更新记录
- 更新 : 1 May, 2018